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专家经验谈:如何开展单细胞qPCR分析(三)

发布时间:2019-07-07 13:02 来源:未知 编辑:admin

  如今,单细胞基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究不再是遥不可及。利用新兴的微流体方法和分子生物学技术,研究人员逐渐能从群体噪音中提取单细胞信号。《Genome Technology》杂志请来了一些专家,来分享他们在单细胞qPCR分析上的经验。通过一问一答的形式,希望能为您的研究带来一点启发。??专家经验谈:如何开展单细胞qPCR分析(二)??专家经验谈:如何开展单细胞qPCR分析(一)Q5:您如何定量单细胞qPCR结果?Mikael Kubista(TATAA生物中心) 单细胞表达谱数据的分析包括三个步骤:normalization、scaling和clustering。用参考基因的表达来均一化(normalization)不适用于单细胞,因为基因表达存在大的、不相关的变化。我们在原先的文章中展示了这一点,自那以后,几乎所有的基因和细胞都证明了这一点,除了mRNA代谢不活跃的细胞(如卵母细胞)外。更好的做法是均一化每个细胞的表达,也就是直接比较测得的量。这是最直观的。当然,这种方法不能说明样品处理过程中的损失,但我们发现那通常可忽略不计。如果您担心样品处理,那么上面提到的RNA加标可用于测定产量和重复性。对于表达谱分析,数据可以多种方法进行分析。数据可能是unscaled、mean-centered或 autoscaled。Mean centering(减去平均值)和autoscaling(减去平均值并除以标准偏差)可平衡分析中标志物的权重。对于单细胞,我们有时候也觉得 Mean centering和autoscaling很有用。Anders St??hlberg(哥德堡大学) 如果避免了预扩增,数据可转换成绝对的cDNA数量,否则数据分析可以Cq值来开展,因为每个细胞的转录本水平呈对数正态分布。一开始,可以各种方法对数据作图,此外,基本的统计分析也应开展(如阳性细胞的数量、平均值和偏差)。细胞数量测定通常是以验证过的参考基因来均一化的。这种策略在单细胞分析中应避免,因为单个细胞中的所有转录本水平随时间变化。我们发现,校正分析和无监督算法(如Kohonen self-organizing maps)对定义亚群和基因网络很有用。Finn-Arne Weltzien(挪威兽医学院) 我们在利用单细胞qPCR进行定量测定时很小心。我们通常只进行定性分析。如果我们定量,我们会利用目的基因的拷贝数相对参考基因的拷贝数。Weiwen Zhang(亚利桑那州立大学,现在天津大学) 对于每个单细胞,我们对目的基因和参考基因进行qPCR分析,如原核生物的16s rRNA和线s或actin。不过,我们也注意到,这些常用参考基因的表达水平在单细胞中也差别很大,对大量细胞qPCR的标准定量法则也须特别谨慎。在大部分情况下,我们报告原始和均一化的Ct值,并使用它们进行单细胞qPCR结果的定量。Q6:您分析时使用哪些生物信息学工具?Mikael Kubista(TATAA生物中心) 我们采用 GenEx进行单细胞分析。事实上,我们在所有qPCR数据分析中使用GenEx。GenEx强大、用户友好,且支持所有领先的qPCR仪器,这让从实验中导入数据和注释很简单。GenEx有着卓越的数据质量评估,对单细胞研究很重要,以及强大的单细胞表达谱工具。它有着用户友好的界面,即使是没有经验的用户也能使用那些强大的工具。Anders St??hlberg(哥德堡大学) 我使用GenEx和SPSS开展数据分析。Weiwen Zhang(亚利桑那州立大学,现在天津大学) 对于几十个基因的分析,我们采用ANOVA student t-test或其他简单的统计学工具。

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